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細胞在發生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發現180-200bp的DNA ladder?;蚪MDNA斷裂時,暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ,從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測,這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。
Tunel染色
(1) 脫蠟:65℃、30min;二甲苯I 10min、二甲苯II 10min ;
(2)水化:將脫蠟后的切片經100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、雙蒸水各3min ;
(3)消化:將玻片浸入胰蛋白酶內消化40分鐘,PBS洗3min×3次。
(4)制備TUNEL反應混合液。
(5)加50μl TUNEL反應混合液于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃反應1h;PBS洗3min×3次。
(6)加50ul POD于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min,PBS洗3min×3次。
(7)DAB染色3-10min,自來水沖洗,蘇木素復染, 1%鹽酸酒精分化,顯微鏡下觀察,控制染色程度。
(8)脫水:75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精,逐級脫水、各3min.
(9)透明:二甲苯透明3min×2次。
(10)中性樹膠封片。
注:
以上是石蠟包埋樣本的處理方式
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