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BALB/c小鼠于第0天和第14天分別腹腔注射0.1mL/只OVA液(0.2 mg/mL)和DBP溶液(0.5 mg/kg),第21~23天連續3天以0.5%的OVA溶液霧化激發,每天于上午下午固定時間霧化2次,每次20min。霧化過程中觀察小鼠一般行為變化,后一次霧化結束后24小時,小鼠摘眼球取血,取支氣管肺泡灌洗液( Bronchial Alveolar Lavage, BALF )及肺組織。
一般行為學觀察 觀察小鼠在霧化過程中是否出現撓臉、毛發豎立、呼吸急促、煩躁不安、大小便失禁等現象。
血中Eos計數 后一次霧化激發結束24h后,小鼠摘眼球取血,獲得血液后立即取出20 μl與380μl 嗜酸性粒細胞稀釋液混勻,利用細胞計數板于光學 顯微鏡下進行Eos計數。
血清中IgE測定 將獲得的血液靜置2h后,離心,3500 rpm,15min,取血清,按IgE ELISA試劑盒說明書進行測定,并通過樣本總蛋白含量進行結果校正。
BALF細胞分類計數 將小鼠仰臥位固定,打開胸腔后,結扎右肺及左側肺上葉。分離并暴露氣管,用適宜針頭進行氣管插管,以預冷PBS反復灌洗肺組織(0.5 mL/次,共兩次),收集BALF,低溫離心( 3500 rpm,10min ),取上清,保存于-20℃待測。細胞沉淀用0.2 mL預冷PBS重懸,吹打均勻后取10 μl于細胞計數板上在光學顯微鏡下計細胞總數,剩余細胞懸液涂片,用快速瑞姬氏染液染色,顯微鏡下進行細胞分類計數。
BALF中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IFN-γ的測定 將獲得的BALF上清根據相關細胞因子檢測試劑盒的說明書進行各指標定量檢測,測定結果經總蛋白含量校正。
肺組織中IL-4和IFN-γ的測定 將右側肺組織用預冷的PBS研磨得15 % 組織勻漿,低溫離心,3500 rpm,15min,取上清按照 ELISA 測定試劑盒的操作步驟進行IL-4和IFN-γ測定,并通過樣本總蛋白定量來進行校正。
肺組織HE及PAS染色 剪取左肺上葉,置10%中性福爾馬林中固定,石蠟包埋,常規石蠟包埋,切片,HE及PAS染色,鏡下觀察肺組織炎性細胞浸潤及黏性蛋白增生情況。
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